瑞士团队利用已知序列首次人工合成活新冠病毒

基因序列构建 2020-02-24 19:17 来源:澎湃新闻 原始标题：人类首次人工合成活新冠病毒：瑞士团队利用已知基因序列构建近日，瑞士一个科研团队在已知新冠病毒基因序列的基础上，通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。该技术能高效合成新冠病毒，尤其在新暴发病毒尚未被成功分离出之前，可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株，且该替代方案更为高效、安全。以上成果披露自预印本网站BioRxiv于当地时间2月21日发表了一篇名为“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”的论文。该尚未经同行审议。研究团队首次在试验中，利用合成基因组学平台快速重建了新冠病毒。值得注意的是，这是一项根据已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作，该成果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关，本研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情暴发后，根据已经公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究。该项研究的作者大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家，他们联合德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构共同完成了上述成果。研究团队认为，利用已知的病毒基因组序列，通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病毒，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株的替代方法，还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征，从而争取时间对疫情暴发做出快速反应。论文中提到，反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。研究团队此次报道了一个基于酵母的合成基因组学平台，用于多种RNA病毒的基因重建，包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员。研究人员可利用病毒分离物、克隆病毒DNA、临床样本或合成DNA生成病毒亚基因组片段，然后使用转化偶联重组技术 (TAR)克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体（YAC），从而在酿酒酵母中实现一步重组。 T7-RNA聚合酶被用于产生病毒RNA ，进而可以产生活病毒。研究团队首先在其他RNA病毒（如鼠肝炎病毒MHV）中检验了这一平台的准确度，团队测试了鼠肝炎病毒A59株中含有绿色荧光蛋白（MHV GFP）的基因克隆能力，结果表明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90％，这表明病毒在酵母中的组装效率很高。也正是利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了工程改造和复活。

病毒cDNA克隆及重组SARS-CoV-2和SARS-CoV-2-gfp的重建具体来看，研究团队将病毒基因组分成12个片段，大小在0.5kbp-3.4kbp 。同时，为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪，研究团队将合成新冠病毒设计成可以表达GFP（绿色荧光蛋白）。因此，研究团队又将片段11分成3个包含GFP序列的子片段， GFP序列被插入ORF7a（开放阅读框， ORF)中从而在总计有14个片段。研究团队让试剂公司化学合成上述14个DNA片段， 1月14日下订单， 2月4日拿到其中的12个片段。片段5和7在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成。不过，研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本（SARS-CoV-2/München1.1/2020/929），他们决定利用RT-PCR扩增获得片段5和片段7 。利用TAR克隆，对于所有6种新冠病毒构建体，研究人员都获得了正确组装的分子克隆。随后，利用转化偶联重组技术 (TAR) ，用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列，将这些DNA序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病毒RNA ，将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6（猴肾细胞）中，使得细胞被感染，培养这些细胞的上清液（含释放出的病毒颗粒）注入到别的培养基中，可以感染别的细胞。研究团队进而表示， “我们能在获取病毒的合成DNA片段后仅一周的时间内，对最近流行的新冠病毒的化学合成克隆进行工程改造和复活。 ”病毒的重组有很高的效率和准确度，通常情况下，超过90%的克隆是正确的。值得注意的是，作者们指出，尽管此前在酵母中进行同源重组已被用于很多分子病毒的克隆，但这一研究在对通过这种方法快速生成大型RNA病毒的全长cDNA的可行性进行了全面评估，尤其是这种大型RNA病毒在大肠杆菌中无法被稳定克隆。