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crispr|基因编辑终于等到诺贝尔化学奖！两位女科学家斩获，为何没有张锋( 二 )


CRISPR-CAS的作用机制证实
CRISPR-CAS生物学功能的证实 ， 使得许多研究团队认识到这一系统的重要性 ， 随后许多研究团队纷纷开始补充CRISPR-Cas系统干扰噬菌体机制的细节 。 2008年 ， John van der Oost研究小组在大肠杆菌中发现 ， 来自噬菌体的间隔序列被转录成小RNA ， 成为CRISPR RNA（crRNA） ， 并引导Cas蛋白到靶DNA上 。 Marraffini和Sontheimer在同年证明了CRISPR-Cas系统的目标分子是DNA ， 而不是RNA 。 他们还明确指出 ， 如果将该系统转移到非细菌系统中 ， 可能成为一种强大的工具系统[9-10] 。 这为随后的基因编辑埋下了伏笔 。
2010年12月 ， Moineau团队证明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置的精确切割使DNA双链断裂 。 而作为II型CRISPR系统的显著特征 ， Cas9是切割唯一需要的蛋白 ， 它与crRNAs共同介导CRISPR-Cas9的干扰功能[11] 。
2011年 ， Charpentier研究组对酿脓链球菌进行了小RNA测序 ， 发现除了crRNA以外 ， 还存在一种小RNA ， 称为式激活CRISPR RNA（tracrRNA） 。 tracrRNA通过24个核苷酸与crRNA中的重复序列互补配对与形成双链 ， 引导Cas9到靶DNA 。 至此 ， 天然CRISPR-Cas9干扰机制的拼图基本拼搭完整[12] 。
CRISPR-CAS基因编辑技术的出现
2012年Charpentier和Doudna团队合作 ， 不仅证明Cas9具有切割DNA双链的能力 ， 还能够将tracrRNA和crRNA链接成sgRNA（single guide RNA） ， 并在体外实验中证实了sgRNA也可以指导Cas9蛋白完成对DNA的双链剪切 。 他们可以通过改变crRNA的序列控制Cas9的靶向位点[13] 。 随后Siksnys团队也报告了相同的发现 。 这一发现不仅是细菌获得性免疫系统领域的里程碑 ， 更开启了CRISPR-CAS基因编辑技术的新篇章 。 很快 ， 2013年初的多篇论文都将CRISPR-Cas系统成功地应用到了哺乳动物细胞中 。 其中 ， Church研究组设计了II型CRISPR-Cas系统 ， 在人293T细胞、K562细胞以及诱导多能干细胞中通过设计sgRNA成功靶向特定序列 ， 且多个gRNA可以实现对目标基因的多重编辑[14] 。 张锋实验室证明了CRISPR-Cas9系统可以在人类和小鼠细胞中进行精确的定点切割 ， 并且将Cas9突变为缺口酶 ， 促进同源修复过程[15] 。 Qi研究组则建立了CRISPRi系统 ， 还实现了多sgRNAs 靶向多基因 (Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty) 的同时定点突变[16] 。 Wu等人利用CRISPR-Cas9系统对Crygc 显性突变的小鼠进行基因治疗使其获得了健康的后代 ， 为CRISPR-Cas9 系统用于遗传疾病的基因治疗提供了依据[17] 。
由此 ， CRISPR系统在多种生物的基因定点编辑、基因组筛选、基因转录调控、基因组成像、基因诊疗、生态应用等领域的研究与应用开始井喷 。 随后几年 ， 张锋实验室更将CRISPR-CAS的基因编辑系统进行了拓展 ， 不仅发现了在特异性和多基因编辑方面都有着很大优势的CRISPR-Cas系统：CRISPR-Cpf1[18] ， 还发现具有RNA酶功能的CRISPR酶Cas13a（C2c2）[19]和Cas13b[20] 。 2017年 ， 有多篇文章研究了CRISPR-Cas13系统的作用机制、在临床诊断中的应用以及在哺乳动物细胞靶向RNA的能力 。
3. CRISPR 基因编辑技术的应用
CRISPR技术迅速发展使得它在转化医学和疾病治疗领域中的应用不断创造出惊喜 。 2015年Science杂志发表了成功使用CRISPR治疗遗传性疾病动物模型的方法 。 他们利用CRISPR系统编辑Dystrophin基因 ， 能够不同程度修复杜氏肌营养不良症小鼠的肌肉功能 ， 从而达到治疗DMD的效果[21] 。 2018年有研究证实利用CRISPR技术成功治疗了四只患有DMD（Duchenne型肌营养不良症）的狗 ， 并将其肌肉和心脏组织中的营养不良蛋白恢复到正常水平的92%[22] 。 此外 ， CRISPR技术还与细胞免疫疗法相结合以完善CAR-T疗法 ， 并在小鼠中增强了肿瘤抑制作用 。 首次利用CRISPR-Cas9在T细胞中敲除PD-1基因的临床试验已被批准用于治疗肌肉浸润性膀胱癌、去势抵抗性前列腺癌、转移性肾癌和转移性非小细胞肺癌 ， 并在2016年开始了I期临床试验[23] 。
4. CRISPR的其他应用
目前 ， CRISPR 并不止在基因组编辑得到了应用 ， 在基因检测方面也展现了巨大的潜力 。 在2017年Science发表的研究中 ， Doudna 团队发现了一个很有趣的现象：CRISPR 系统在剪切靶向的双链 DNA 的同时 ， Cas12 的 DNA 酶活性会被激活[24] 。 这个发现为检测细胞内是否含有某目的DNA 提供了一个全新的思路：同时向细胞内递送靶向该 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系统和非特异性 ssDNA 荧光报告基因（FQ-labeled reporter） ， 一旦检测到目的 DNA ， CRISPR-Cas12a 系统将启动 ， 与此同时 ， 荧光报告基因也会被降解 ， 从而释放出荧光信号 。 利用这一技术 ， Doudna 团队开发了DETECTR系统 ， 能够在一小时内100%准确检测出 HPV 16 感染 ， 且单次测试成本不到一美元 。 与此同时 ， 张锋团队也利用CRISPR-Cas13a开发出了SHERLOCK系统和SHERLOCKv2系统[25] ， 与Doudna团队不同 ， 张锋团队设计的荧光报告基因必须是特异性 ， 也正是“特异性”这个优点使得 SHERLOCKv2 可以同时检测多种序列 。 张锋团队还开发了类似验孕棒的试纸检测方法 ， 只需一张试纸 ， SHERLOCKv2 就能显示出病毒感染的检测结果 ， 这使得检测更为便利 。 在今年COVID-19的检测技术开发中 ， SHERLOCKv2也曾一显身手 。


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