万历二十七年（1599），杨应龙在播州作乱，马千乘率三千人随李化龙前往征讨，秦良玉率领五百精兵押运粮草，与副将周国柱扼守邓坎。杨应龙军趁李部大军在营中大摆筵席发动袭击，马、秦夫妇当先将其击败，而后乘胜追击，接连攻破金筑关等七个营寨，而后大破杨军。
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秦良玉为南川路战功第一，却不自报军功。
万历四十一年，马千乘被监军太监邱乘云诬告，病死于云阳监狱。由于马千乘为世袭土司，长子祥麟年幼，故以秦良玉代领亡夫职位。明泰昌元年（后金天命五年，1620年），后金大汗努尔哈赤挥师入侵明驻辽东，朝廷诏令秦良玉出兵援助，赐其三品官员的服饰。
秦良玉作为一个女人，正式成为了明朝中央记录在册的高级军事长官。
秦良玉先派兄弟秦邦屏、秦民屏率数千兵马，随援剿总兵童仲揆渡浑河，与后金八旗兵血战。激战数战，哥哥秦邦屏战死沙场，弟弟秦民屏突围而出，秦良玉亲率土兵三千前往直抵山海关，所经过的地方秋毫无犯。明熹宗封秦良玉为诰命夫人，加二品服饰，并封其子马祥麟为指挥使。
浑河一战，秦良玉所属军队虽为贵州土兵，但浴血奋战，军功卓著。
兵部尚书张鹤鸣说：“浑河血战，首功数千，实石砫、酉阳二土司功。邦屏既殁，良玉即遣使入都，制冬衣一千五百，分给残卒，而身督精兵三千抵榆关。上急公家难，下复私门仇，气甚壮。”（《明史·秦良玉传》）
秦良玉受封授都督佥事，充总兵官。明时总兵官为战时之需，虽无品级，却有实权，多以挂五军都督同知出镇地方总兵官，而秦良玉作为偏远地方的土官太夫人出任总兵官，也是史上唯一一例。
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明崇祯三年（后金天聪四年，1630年），皇太极在明朝关宁锦防线难以攻克的情况下，使计稳住辽东经略袁崇焕，率军借道蒙古科尔沁部，突入内地，进围京都。
秦良玉奉诏勤王，拿出家中资产充军饷。明思宗朱由检在平台召见秦良玉，除赏赐钱币牲畜酒水等外，还赋诗四首纪其功劳。
皇太极兵退后金，秦良玉率部还乡，多次击溃张献忠作乱的部队。本有机会彻底解决张献忠问题，秦良玉向四川巡抚邵捷春请战，愿出两万土兵作战，拿出家产自筹一半粮饷，请朝廷资助一半，怎知邵氏与前来督战的“督师辅臣”、兵部尚书杨嗣昌闹矛盾，加之府库空虚，使秦良玉回天乏力，叹息“邵公不知兵。吾一妇人，受国恩，谊应死，独恨与邵公同死耳”。
督抚倾轧，留给有心报国者空有用武地，也留给了张献忠盘踞四川坐大、蚀空明朝后方的机会。
崇祯十六年，张献忠攻陷武昌，将楚王朱华奎沉入长江，率兵再犯四川。花甲老妇秦良玉上呈全四川形势给巡抚陈士奇，建议派兵守十三个关隘，陈士奇不用。
秦良玉又找到巡按刘之勃，刘同意秦策，却无兵可派。
明朝覆灭，虽是破关入主的清军成为了最后的胜利者，但张献忠与李自成的内乱声势浩大，让明朝貌似强大而困于内忧无法解决而内部掣肘应对外患时，受到了致命一击。
崇祯十七年（1644），张献忠领大军长驱直入，再次进犯夔州。
秦良玉率土军前往救援，但寡不敌众，被击溃。
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张献忠攻下成都，“全蜀尽陷”，秦良玉对部下说：“吾兄弟二人皆死王事，吾以一孱妇蒙国恩二十年，今不幸至此，其敢以余年事逆贼哉！”（《明史·秦良玉传》）
秦良玉决心已定，召集部众下令“有从贼者，族无赦！”遂分兵守卫石砫境。张献忠到处招降四川土司，却不敢来秦良玉的石砫。
两年后，远在福建的隆武帝朱聿键派使节专程赴石柱，加封秦良玉太子太保衔，封忠贞侯。
近在西南的永历帝朱由榔，封秦良玉为太子太傅，任四川招讨使，仍以镇东将军督兵平定川中诸贼。
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