微流控技术的应用前景_微流控芯片的前景如何？( 四 )
miRNA文库的一大限制在于RNA的起始量低（<200ng 总RNA）；短接头二聚体在RT-PCR反应中与目的产物、接头和miRNA进行竞争 。当存在太多二聚体时 ， 他们会在片段筛选时充斥整个凝胶 ， 污染产物条带 。为了尽量避免这种情况 ， 很多试剂盒采取了各种方式来避免二聚体的形成 。
对于mRNA测序文库 ， 方法主要包括利用随机引物或oligo-dT引物进行cDNA合成或在mRNA片段上加接头后进行某种形式的扩增 。mRNA可以由随机引物或oligo-dT起始产生一链cDNA 。如果使用随机引物 ， 必须先将rRNA去除或减少 。rRNA可以通过寡核苷酸探针为基础的试剂 ， 比如 ， Ribo-Zero和RiboMinus ， 进行去除 。另外 ， polyA RNA可以通过oligo-dT磁珠进行正向筛选 。
通常希望文库能够留有原始目的RNA的链的 方向性。比如 ， 逆转录产生的反义RNA在调节基因表达中发挥作用 。实际上 ， lncRNA分析依赖于定向RNA测序 。制备定向RNA-seq文库的方法有几种 。逻辑时 ， 进行cDNA反应 ， 将两条链中的1条有选择地移除 ， 通过 ， 在第二条cDNA链合成时加入dUTP 。尿嘧啶包含的链可以被响应的酶消化掉或者扩增的时候用不识别尿嘧啶的聚合酶 。另外 ， 加入actinomycin D可以减少一链cDNA合成过程中假义链的合成 。
另一种杂交方法利用随机或锚定oligo-dT引物的接头序列起始第一链cDNA的合成 。接下来 ， 在模板转换步骤 ， 3端接头序列添加到cDNA分子 。这种方法的明显优势在于第一链cDNA分子可以利用3端的唯一序列标签无需进行第二链合成 ， 直接通过PCR进行扩增 。5端唯一序列标签在第一链合成过程中引入 。
用于cDNA合成的引物设计对于RNA-seq文库非常重要 。比如 ， rRNA序列可以通过设计靶向rRNA的引物（不用于进一步扩增）进行去除 。NuGEN Ovation RNA-seq结合SPIA（ Single primer isothermal amplification ）核酸扩增技术以及用于第一链cDNA合成的引物来抑制rRNA的扩增 。另一种方法中利用4096种六聚体来抑制rRNA序列（识别并消除完美匹配） 。749种六聚体保留并用于起始第一链cDNA合成反应 。结果是 ， rRNA reads从78%降至13% 。还有一种方法叫 ， DP-seq ， 利用44个7聚体引物扩增了大部分的小鼠转录本 。这种引物设计选择性地抑制了高表达转录本的扩增 ， 包括rRNA ， 并提供了胚胎发育模型中低丰度转录本的估计 。
最近发表了一些制备单细胞RNA文库的方法 。一种方法利用第一链cDNA的多聚核苷酸尾巴 ， 结合模板转换反应 。结果是第一链cDNA产物可以通过通用PCR引物进行扩增 。如图 ， Figure4B所示 ， 且已并入是试剂盒中 。另一种方法叫 CEL-Seq ， 在cDNA 5端合成T7启动子序列 ， 随后在体外转录过程中进行现象扩增 。
单个细胞的总RNA一般为10pg ， 但polyA RNA只有0.1pg 。因此 ， 这些方法某种程度上需要全转录本扩增以产生足够的建库所需起始量 。这样大量扩增的弊端就在于大量技术噪音的产生 ， 这一问题目前尚未解决 。（？）
最后 ， 核糖体印记能够反应翻译的任何节点上细胞mRNA转录本的混合 。这种方法涉及到利用RNase对细胞进行裂解 ， 只留下被核小体保护的30个核苷酸的区域 。核小体经蔗糖梯度密度离心进行纯化 ， 接着mRNA被从核小体中提取出来 。另一种新的RNA测序的应用是 SHAPE-Seq ， 通过酰化试剂来偏向性地修饰未配对的碱基以探索RNA的二级结构 。通过对修饰的RNA和未修饰的对照进行逆转录 ， 对得到的cDNA片段进行测序 ， 比较后能够揭示核苷酸水平的碱基配对信息 。
Q5：微流控芯片的前景如何？微流控芯片是当今社会发展的热点 ， 但是还是存在很多问题有待解决 。
依赖性太强 。微流领域微流体分析芯片最初只是对纳米技术革命的补充 ， 它发展了20年 ， 产生了大量新设计 ， 新工艺 ， 新材料 ， 和知识产权 。它就像一个工具箱 ， 现在装着一整盒子的工具 。可工具本身是不值钱的 ， 工具要能解决实际的问题时 ， 才会变得值钱 。微流控没法作为一个行业的核心竞争力 。大多数情况下微流控只是提供一个工程技术解决方案 。
无法形成有效的生态链 。无论是企业的大小都没有自发形成一个有效的生态系统 。当前的研发模式还是处于混乱的 ， 该行业还远未成熟 。当行业有一个生态系统时 ， 行业可以集中资源解决其子领域的关键问题 ， 从而避免重复同样问题的循环 。
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