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李兰娟团队：新冠突变影响致病性，体外感染显示270倍差异( 三 )


他们认为 ， 研究这种三核苷酸突变的功能影响将是非常有趣的 。 值得注意的是 ， 在目前的数据库中 ， 另一个三核苷酸突变（G28881A, G2882A和G28883C）已被鉴定出 ， 也导致了两个蛋白水平的错义突变 。
研究人员还提醒一点 ， 与最近报道的不能从粪便样本中获得活病毒相反 ， 这项研究中有3个病毒分离株是从粪便样本中提取的 ， 研究表明新冠病毒能够在粪便样本中可以复制 。
系统发育分析揭示不同的进化史
为了从已有的新冠病毒测序数据中了解11株病毒分离株的系统发育背景 ， 研究人员从GISAID（下载于2020年3月21日）获得了725个高质量、高覆盖的新冠病毒基因组 ， 其中包括2013年在云南中华菊头蝠中采集的RaTG13病毒株和广东穿山甲病毒株作为外群 。
研究人员构建了一个包含736个病毒序列的最大似然系统发育树 ， 得到的系统发育树与GISAID上更新的系统发育分析基本一致 。
研究观察到相当多的始祖突变 。 具体来说 ， 在这项系统发育分析中 ， 研究人员注意到以下三个最大的簇：第一、在231个病毒序列中发现三个核苷酸突变C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇） ， 大部分在欧洲分离获得；第二、在208个病毒序列中发现两个核苷酸突变C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇） ， 在这项分析中它们不是单源的(图2A和图S3) 。 然而 ， 在ORF8-L84S簇内的92个基因组序列上可以观察到明显的单源亚支（subclade） ， 主要由来自美国西雅图的病毒序列组成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34个病毒序列中发现两个核苷酸突变G11083T (ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V) ， 其中大部分来自荷兰和英国 。
研究人员提到 ， 还可以观察到几个由不同的始祖突变集定义的较小的单源簇 。 例如：第一、31个病毒序列发现了G1937A (ORF1a中的V378I)突变；第二、12个病毒序列中发现了G1440A和G2891A突变 ， 导致了ORF1a基因的G392D和A876T突变 ， 大部分来自德国或荷兰；第三、8个基因组序列中发现了C15325T和C29303T突变 ， 导致了N基因的P344S突变 ， 来自中国或日本 。
李兰娟团队：新冠突变影响致病性，体外感染显示270倍差异
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研究人员将11株病毒分离株整合到系统发育分析中 ， 它们分散在整个系统发育空间中 。 ZJU-1与ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V组聚类 ， 它同时具有这两种典型的突变 。 另一方面 ， ZJU-2与ZJU-8和ORF8-L84S聚类 ， 它们都有两个始祖突变 。 由于上述T22303G突变 ， ZJU-9和ZJU-11与澳大利亚的一个分离株聚类 。 其他毒株则或者突变较少 ， 或者没有与任何已知的大规模群体聚集的新突变 ， 这反映了这11个样本的广泛多样性 。
综上所述 ， 研究人员认为 ， 一些单源病毒群确实表现出明显的地理模式（特别是欧洲和美国） ， 但这可能是由于在大流行初期发生各自突变的“始祖效应” 。
感染Vero-E6细胞时 ， 病毒拷贝数和细胞病理效应有显著差异
目前来看 ，COVID-19患者表现出多种临床症状 ， 流行病学研究表明 ， 临床结果受个体年龄、并发症和其他潜在未知参数的严重影响 。 为了检测患者来源的新冠病毒分离株的突变影响 ， 研究人员进行了体外感染试验 。
李兰娟团队：新冠突变影响致病性，体外感染显示270倍差异
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研究人员首先检测了病毒分离株是否能如预期那样成功地与Vero-E6细胞结合 ， 并以S蛋白形成的标志性“皇冠”来直观识别病毒颗粒 。 然后 ， 他们用所有11个病人来源的病毒分离株感染Vero-E6细胞 ， 并在感染后1、2、4、8、24和48小时收集细胞 。 在48小时和72小时时分别取细胞的DIC显微照片来评估CPE 。


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