李兰娟团队：新冠突变影响致病性，体外感染显示270倍差异( 四 )
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他们使用针对ORF1a、E和N基因的特异性实时转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测新冠病毒的存在 。 循环阈值Ct用于量化病毒载量 ， 较低的值表示较高的病毒载量 。 由于这三个基因的结果高度一致 ， 他们只讨论ORF1a基因的结果 。
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简要来说 ， 所有病毒分离株样本感染后1、2、4小时的Ct值保持平稳 ， 仅有小的波动 。 在这些较早的时间点上 ， 病毒粒子结合入侵细胞 ， 病毒复制在这个阶段很少发生 。
在感染后8小时 ， 研究人员观察到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值显著下降 ， 即意味着病毒载量增加 。 感染后24小时 ， 观察到除了ZJU-2和ZJU-7外 ， 所有病毒分离株的Ct值都显著下降 ， 其中一些病毒分离株 ， 即ZJU-10和ZJU-11 ， 下降速度比其他病毒快得多 。 感染后48小时 ， 除ZJU-10和ZJU-11外 ， 所有病毒分离株均有小幅度下降 ， 研究人员推测ZJU-10和ZJU-11在24小时时均已趋于稳定 。
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值得注意的是 ， 感染后24小时 ， ORF-8-L84S簇成员ZJU-2和ZJU-8（大部分来自美国华盛顿州西雅图）的病毒载量显著降低 。 另一方面 ， 与S-D614G分支(主要在欧洲发现)同簇的ZJU-1病毒载量是ZJU-2和ZJU-8的19倍 。 此外 ， 在感染后24小时 ， ZJU-10和ZJU-2的病毒载量相差近270倍 。
论文提到 ， 这些差异在48小时变得有统计学意义 ， 在分析基因E和N的数据时是可重复的 。 因此 ， 研究人员认为 ， 不同的病毒分离株在感染Vero-E6细胞时表现出显著的病毒载量变化 ， 这是由其基因组的不同突变决定的 。
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接下来 ， 研究人员检验了病毒载量增加是否会导致更多细胞死亡 。 在感染后48小时和72小时显微镜下观察这些细胞系 ， CPE或细胞死亡率与病毒载量数据高度一致 ， 表明病毒载量越高 ， 细胞死亡率越高 。
他们在讨论环节提到 ， 由于患者表现出的临床症状极为多样 ， 在患者中建立基因型与表型的联系将是非常困难的 。 体外细胞系提供了一个理想的系统 ， 以检查不同的分离病毒株突变的影响 。
他们认为 ， 虽然Vero-E6细胞系并非来源于人 ， 但Vero-E6细胞系的ACE2蛋白与人的ACE2蛋白高度相似 ， 直接证明了新冠病毒可以感染该细胞系 。
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