「新浪科技综合」CRISPR两大先驱合作，揭示单碱基编辑易脱靶的原因新浪科技综合2020-08-03 17:12:280阅
来源： 学术经纬
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图1/62012年 ， 被喻为“上帝的手术刀”的CRISPR-Cas9系统横空出世 ， 短短的八年里 ， 这种工具已经应用到包括医药、农业、基础科研等诸多领域 。 以经典的CRISPR-Cas9为基础 ， 科学家们还开发出一系列工具 ， 例如可以转换单个核苷酸的碱基编辑器 ， 以期治疗单基因点突变导致的遗传疾病 。 然而 ， 这些先进的新技术并非完美 ， 其可能的脱靶效应及潜在的安全隐患同样十分引人关注 。
日前 ， 基因编辑领域的两位宗师级科学家Jennifer Doudna教授和刘如谦（David Liu）教授联手 ， 在《科学》杂志上报道了一种碱基编辑器的首个详细3D结构 。 “这一结构帮助我们从更深层次上理解碱基编辑器 ， ”加州大学伯克利分校的Doudna教授说 ， “我们现在可以看清它是怎么工作的 ， 就可以制定明智的策略来改良这个系统 。 ”
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图2/6【「新浪科技综合」CRISPR两大先驱合作，揭示单碱基编辑易脱靶的原因新浪科技综合2020-08-03 17:12:280阅】Doudna教授与合作者在2012年发现 ， 细菌中找到的CRISPR能用于基因组编辑 。 本质上看 ， CRISPR-Cas9是蛋白质和RNA的混合体 ， 它们能够精确地瞄准一段特定的DNA ， 然后像剪刀一样剪开这段序列 。
此后 ， 哈佛大学和麻省理工学院Broad研究所的刘如谦教授等人开发出了首款碱基编辑器 ， 将经过修饰的Cas9（禁用了其DNA剪接功能）与另一种细菌蛋白（脱氨酶）结合 ， 无需使DNA断裂 ， 就能定点修改基因中的单个碱基 。 这种碱基编辑器可以把DNA双链上的腺嘌呤（A）-胸腺嘧啶（T）组合替换为鸟嘌呤（G）-胞嘧啶（C）组合 。 在人类遗传疾病中 ， 大约60%（超过15000种）的致病单碱基变异有望利用现有的碱基编辑器来纠正 。
研究人员在论文中指出 ， 早期的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）效率很低 ， 但经过多次筛选 ， 最新的版本ABE8e速度提高了约1100倍 ， 能在15分钟内完成几乎100%的碱基编辑工作 。
但除了效率提升外 ， 要将碱基编辑器应用到人类遗传疾病的治疗上 ， 科学家们还迫切想要解决“脱靶效应” ， 也就是针对无关DNA片段的编辑 。
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图4/6图片来源：123RF蛋白质结构一直和其功能有密切的联系 。 因此 ， 科学家希望通过解析蛋白质结构 ， 找出与Cas9融合的蛋白为何会产生脱靶效应 ， 以及如何优化 。 “作为一个结构生物学家 ， 我真的想看清一个分子并思考如何合理地改进它 。 ” 共同第一作者Gavin Knott博士说道 。
在最新的这篇《科学》论文中 ， 研究人员利用冷冻电镜技术（cryoEM） ， 以3.2埃的分辨率解析了ABE8e结合DNA时的3D结构 。
“虽然碱基编辑器现在被广泛应用于生物体 ， 从细菌到植物再到灵长动物 ， 进行精确修饰 ， 但目前为止还没有人观察到碱基编辑器的三维分子结构 ， ”刘如谦教授说 ， “这个合作项目揭示了一个美丽的分子结构：先进的、高度活跃的碱基编辑器ABE8e在与目标DNA位点接触时被捕获的瞬间 。 ”
“这让我们第一次看到 ， 碱基编辑器以两个独立模块进行工作：Cas9模块提供特异性 ， 还有一个催化模块提供活性 。 ” 论文的共同第一作者Audrone Lapinaite博士描述道 。
结构学数据与酶活检测揭示了ABE8e容易产生脱靶的原因 。 原来 ， 连接在Cas9上的脱氨酶始终处于激活状态 。 Cas9在细胞中找到预定目标之前 ， 会不断结合并释放成百数千个DNA片段 。 换言之 ， 始终处于激活状态的脱氨酶让Cas9变成一门容易走火的大炮 ， 不等Cas9完全匹配到目标 ， 就直接开炮 。
这一结果为科学家们重新设计与碱基编辑器带来了新的洞见 。 “如果想设计真正的特异性融合蛋白 ， 必须找到一种方法使其催化结构域完全成为Cas9的一部分 ， 这样才不会一直处于活跃状态 ， 而是只有在Cas9正确结合到目标后才被激活 。 ” Lapinaite博士说 。
此外 ， ABE8e的结构数据还阐明了新版本碱基编辑器速度更快的秘诀 。 研究人员发现 ， 相比早期版本 ， 新版本上有两个点突变 ， 可以使蛋白质更紧密地抓住DNA ， 从而更有效地把A替换为G 。
“这种结构和相应的生物化学让人兴奋 。 我们现在可以对这个系统在细胞中的表现作出理性的预测 。 ”Knott博士补充道 。
研究人员指出 ， 这项新研究展示了Cas9融合蛋白的首个结构 ， 因此其结果将为众多从Cas9衍生的基因编辑工具提供设计指导 ， 有助于带来更方便、更可控、更有临床应用价值的基因编辑工具 。 我们期待进一步改良的碱基编辑系统 ， 可以在不远的将来为遗传病患者带来治疗希望 。
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