[赛医学]病毒核酸检测标准化：标准物质的种类及制备( 二 )
2.原始材料的均匀性原则
由于原始材料可能为多个来源 ， 因此必须严格混匀以保证材料的均匀性 。 原始材料可以分成相同的几份或不同的几份 ， 一次制备两批次或多批次的候选国际标准物质 ， 如NIBSC在制备第一代HCV 核酸检测用国际标准时 ， 除制备了两批次冻干粉候选标准物质外 ， 还制备了一批次的液体候选标准物质 ， 这样可以监测制备过程对标准物质的影响是否相同和选择国际标准的最佳保存形态 。
3.有代表性及靶病原体含量高的原则
筛选的自然存在的病毒应具有代表性 ， 并且目的分析物含量要高 。 要注意病毒的不同的基因型的分布、病毒核酸常用于核酸扩增检测区域的保守性 ， 避免使用含有已发生变异的特殊病毒的原材料 。
4.容易大量获得
易大量获得 ， 可有效地保证标准物质的制备原材料有足够的来源 ， 一次也可大量制备 ， 也可有效地保证成品的均一性 。
5.无纯度要求
用于病毒核酸制备的原材料可以是纯的病原体或培养物 ， 也可以是混杂在临床标本的混合物 ， 只要其基质中不含影响检测的物质即可 。
6.生物安全性
用于病毒标准物质制备的原材料一般均来自于感染者的标本 ， 均具有生物传染危险性 ， 因此 ， 在不影响靶核酸的稳定性的情况下 ， 应尽可能在制备前进行灭活处理 。 理想情况下 ， 是采用无生物传染危险性的原材料如体外克隆表达的病毒样颗粒来制备 。
7.防污染
处理原始材料时 ， 要注意防止物理、化学和微生物方面的污染 。
8.人工合成的病毒核酸的筛选
选择人工合成的病毒核酸作为相应标准物质制备的原材料时 ， 合成核酸片段序列选择、长度和理化特性应适用于临床使用的商品试剂盒 ， 特别要注意的是适用于不同的核酸纯化方法 。 其生物安全性、易获得性、使用的方便程度均应明显好于天然候选物 。 但裸露的RNA 容易受核糖核酸酶的降解而稳定性差 。
二原材料的分装标准物质在液体分装时 ， 会造成分装体积的不均匀 。 因此在分装过程中 ， 每隔一定数量都会抽取一分装单位进行称量 ， 并通过称量结果计算分装的变异系数 。 如NIBSC在制备病毒核酸检测用HAV RNA、HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA和B19 DNA国际标准时 ， 采用称重的方法确定分装的不确定度分别为0.29% 或0.39%、3.2%、0.4%和0.6%、0.63%和0.71% 。 并在分装时尽量避免生物的 ， 化学的或灰尘污染 ， 操作可以在清洁级的房间内操作或在配备高效微粒空气过滤器的层流柜中操作 。 分装应尽快在短时间内完成 ， 以确保同一批次所有的分装单元是在同一时间同样条件下分装 。
此外 ， 分装用分配器、检测用仪器均应进行校准 。 所有用于制备的玻璃器皿或一次性消耗品均应经过高压灭菌消毒 。 用于制备RNA的玻璃器皿应经过去核糖核酸酶的处理 ， 一次性消耗品应为无脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的制品 。
本文插图
本文内容摘自李金明教授主编《实时荧光PCR 技术》(第2版)第9章 病毒核酸检测的标准物质及其应用 。
《实时荧光PCR 技术》（第2版）系统阐述了实时荧光PCR技术的基础理论和临床检测方法 。 本书是从事临床疫病研究、诊治的重要参考书 ， 适合临床检验专业技术人员、各级临床医师和医学院校师生阅读参考 ， 也可作为推广应用此项技术的培训教材 。
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