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肿瘤时间肺癌精准治疗的新靶标——MET 14 号外显子跳跃突变的检测( 二 )


RT-PCR/RT-qPCR——准确快速 ， 但临床应用缺乏质量控制标准
基于 mRNA 层面上的检测主要有逆转录 PCR（RT-PCR）后测序 ， 或临床上相对使用比较成熟的实时定量逆转录 PCR（RT-qPCR）的方法 。
逆转录 PCR 后测序法首先以 mRNA 为模板 ， 在逆转录酶的催化下采用 MET 13 号外显子的正向引物、MET 15 号外显子的反向引物引导下合成互补的 DNA（cDNA） ， 再使 PCR 拷贝 cDNA 片段后进行 Sanger 测序；RT-qPCR 法则是采用特异性的实时定量逆转录试剂盒在逆转录之后通过实时荧光定量 PCR 检测 MET 14 号外显子缺失的 MET RNA 转录本 ， 一般 Ct（循环至阈值）值 < 33 被认为是 MET 14 号外显子缺失的 mRNA 阳性 ， 而 Ct 值 ≥ 34 为阴性 [3] 。
然而 ， 上述两种方法均以检测缺失 MET 14 号外显子的 mRNA 为原理 ， RT-PCR 后测序法步骤繁琐；而 RT-qPCR 法虽然能够较准确快速地探测到 MET 14 号外显子跳跃突变的存在 ， 但目前临床应用缺乏质量控制标准 ， 例如试剂、流程的标准化 ， 以及阳性截断值的统一标准 ， 上文所述的通过 Ct 值判断 MET14 号外显子缺失的阳性标准也仅为参考 ， 不同研究采取的标准不尽相同 [3] ， 因此基于 mRNA 层面的方法尚未获得相关指南及共识的推荐 。
NGS——所需样本量少 ， 高敏感性 ， 可定量分析
NGS 技术分为基于 RNA 的转录组测序（RNA-Seq）及基于 DNA 的杂交捕获的大规模靶向测序 panel（DNA-Seq）或全外显子测序（WES） 。
基于 DNA 的 NGS 技术主要是大规模靶向测序 panel 和报道较少的 WES 。 常用的 NGS panel 检测特异性突变的步骤主要包括 DNA 的提取和总 DNA 文库的构建、定制基因 panel、文库测序和杂交捕获筛选 。此技术可在 DNA 层面上直接鉴定出 MET 14 号外显子区域碱基对突变的具体情况 ， 目前是用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变最常用的手段 。
然而 ， 目前市售的 DNA NGS panel 最多只能检测到 63% 的已知 MET 14 号外显子跳跃突变 [4] ， 部分尚未报告的突变可能并不包含于 panel 中 ， 却依然能引起 MET 14 号外显子错误剪接和跳跃突变 ， 造成 DNA-Seq 检测结果的假阴性 。
NGS 在国内外的应用现状及痛点
目前在中国 ， 仅有 NGS 得到了 2019 版 CSCO 指南用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变方法的推荐 ， 且 DNA NGS panel 也已经在临床用于检测患者包括 MET 14 号外显子跳跃突变在内的多种驱动基因改变 ， 尤其是在接受二线靶向治疗的患者中利用外周血游离 DNA 标本的检测 [5] 。 但 NGS 面临着实际应用中成本较高、缺乏可靠且统一的临界值标准、中国市场仍无足够靶向治疗药物等限制了 NGS 在 MET 检测上的应用 ， 另外在国内也缺乏对比使用外周血标本及组织学标本检测结果之间一致性的相关研究数据 。
而在国外 ， 随同选择性 MET 抑制剂一同获批的还有用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的伴随诊断工具（ArcherMET 和 FoundationOne CDx） 。 这些诊断工具均基于 NGS 原理 ， 利用锚定多重 PCR 技术创建基因组文库从而探测液体活检（即血液 ctDNA）和组织样本（RNA）来源的 MET 14 号外显子跳跃突变 。
最新研究 [6]发现 ， 液体活检和组织样本两种检测方法分别阳性的患者对于 MET 靶向治疗的疗效反应相似（48% vs 50%） ， 且两种方法共同阳性的患者（n=27）分别占单一方法阳性的比例也相似（41% vs 45%） ， 提示这两种方法都可作为这一突变的 NGS 检测手段 。 然而 ， 目前尚缺乏直接对比基于 ctDNA 或组织 RNA 的 NGS 敏感度、特异性的研究 。
小 结
现有用于检测 MET 14 号外显子跳跃突变的方法中 ， DNA 一代测序假阴性率较高；RT-qPCR 及 NGS 是目前临床应用较多的方法 ， 而 NGS 是目前唯一获得指南推荐的 MET 14 号外显子跳跃突变的检测方法 。 但成本较高、缺乏可靠统一临界值标准等因素限制了 NGS 检测 MET 14 号外显子跳跃突变的进一步应用 。


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