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看见病毒：显微镜的百年历程

突然袭来的新冠肺炎疫情让人类又一次见识了“病毒”的威力 。肉眼看不到的病毒作为一个物种 ， 很可能从地球生命诞生之初就已经存在 ， 而人类从意识到有病毒存在→看到病毒的模样→弄清病毒的内部结构成分却经历了漫长的过程 。 病毒在19世纪末已被证实肯定存在 ， 但因“阿贝极限”使光学显微镜无法达到更高的分辨率 ， 始终看不到病毒的踪影 。撰文 | 小溪20世纪30年代 ， 电子显微镜的发明使神秘的病毒终于现出了真身 ， 只是电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的观察及获取生物活动的动态信息 ， 而攻克致病病毒 ， 需要深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的动态过程 。科学界期待着能有可获取生物过程动态信息的、更高分辨率的光学显微镜 。光学显微镜的“阿贝极限”究竟有没有可能被突破呢？尽管每项科学技术的发展都会历尽艰辛 ， 只是没想到 ， 真正突破“阿贝极限”竟用了百余年 ， 在此期间数项新技术的发明起到了极为关键的作用！相 衬“相衬”是显微技术中的一个重大进步 。光学显微镜观察细胞时一般都需要染色 ， 这是因为细胞结构中大部分组分都是透明的 。 透明度高的物体也称为位相物体 ， 光波通过位相物体时不改变振幅 (光的强弱) 只改变位相 ， 但人眼只能辨别出振幅的变化 ， 因此在光学显微镜下难以区分不同的细胞组分 。用有机染料对不同的细胞组分进行选择性染色后 ， 可借助不同的颜色反衬来提高细胞不同组分图像的对比度 ， 便于更清楚地进行观察和研究 。 但染色是一个非常困难和耗时的过程 ， 常常会对观察的生物样本产生伤害 ， 甚至杀死细胞 。看见病毒：显微镜的百年历程
波的位相示意图有没有办法让光学显微镜的生物样本可以不经染色而直接清楚地观察到活细胞的内部结构呢？20世纪30年代初 ， 荷兰的弗里茨·泽尼克 (Frits Zernike) 在实验中偶然发现：不可见的光相位变化可以转变为可见的振幅变化 ， 他根据位相理论研究出了位相反衬法 (一种光学信息处理方法)， 通过某种空间滤波器将位相变化产生的不可见信息转化为与之等价的可见的振幅信息 ， 改善透明物体成像的反衬度 ， 可大大提高透明物体的可分辨性 。看见病毒：显微镜的百年历程
弗里茨·泽尼克(Frits Zernike)泽尼克利用光的干涉原理 ， 在传统的光学显微镜中加入相位板 (将位相差转换成振幅差) 研制出相衬显微镜 (Phase Contrast Microscope ， 简称PCM) 的原型机并申请了专利 ， 可惜当时他的发明没有受到重视 。第二次世界大战的爆发影响了泽尼克的研究 ， 但他以百折不挠的精神不断改进技术 。 1941年 ， 第一台实用的相衬显微镜终于在蔡司公司诞生 。 当时的显微镜观察细胞时都需要染色 (染色会杀死细胞)， 而相衬显微镜则可直接观察到活细胞的内部结构 。目前 ， 大部分高级光学显微镜及电子显微镜中都配置了相衬部件 。 相衬显微镜在细菌学、病理学等方面应用广泛 ， 生物学研究因此有了极大突破(泽尼克因论证相衬法及发明相衬显微镜的贡献获1953年诺贝尔物理学奖) 。看见病毒：显微镜的百年历程
早期的相衬显微镜看见病毒：显微镜的百年历程
下排是透明样品加上相衬技术后的显微图像荧 光荧光的发现为后来超分辨率光学显微镜的研制打下了基础 。早在1845年 ， 英国皇家学会的约翰·赫歇尔 (John Herschel) 在一份报告中描述了他观察到的一种现象：加了硫酸奎宁 (一种药物) 的苏打水在太阳光照射下会发出天蓝色的光 。 以后 ， 虽然也有人发现类似的现象 ， 但一直没人能给出科学的解释 。看见病毒：显微镜的百年历程
约翰·赫歇尔(John Herschel)1852年 ， 英国的乔治·斯托克斯 (George Stokes) 在他的巨著《论光的折射率变化 (On the Change of Refrangibility of Light) 》中指出：用分光计观察太阳光照射奎宁和叶绿素的水溶液时 ， 只有当溶液置于光谱的紫外光区域才会产生所发光的波长比入射光波长要长效果 。斯托克斯判定：这种现象是由于这些物质吸收光能后重新发射出不同波长的光 (属光致发光) ， 并非因光的漫射作用引起 ， 他把这种光称为荧光 (Fluorescence) 。1864年他在一次演讲中首次提出：荧光可作为一种分析工具 ， 可惜他的建议没能被很快地应用于光学显微成像技术 。看见病毒：显微镜的百年历程
乔治·斯托克斯(George Stokes)过了40多年 ， 德国的奥古斯特·科勒 (August Köhler) 与亨利·西登托普夫 (Henry Siedentopf) 于1911年研制出首个荧光显微镜 (Fluorescence Microscope) 测试装置 。当时的荧光显微镜以紫外光线为光源 ， 用荧光色素对观测目标 (细菌、植物、动物组织等) 进行染色处理 ， 紫外光的照射会激发观测目标上的荧光物质发出荧光 ， 研究者根据自发荧光的成像开展研究 。荧光显微镜可用于观察细菌、植物和动物组织中的自发荧光现象 。 但因植物和动物组织中的自发荧光很弱 ， 加之当时相关的技术还不够成熟 ， 荧光显微镜的应用在20世纪初期发展较慢 。


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