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微生物检验方法的介绍及其意义( 二 )


血细胞计数平板法:
血细胞计数板是一种具有特殊结构尺度和厚度的厚玻璃片 。滑块上有四个凹槽和两个脊 ， 中间有一个短的横向凹槽和两个平台 。两个脊的表面比两个平台的表面高0.1毫米 。每个平台上刻有不同规格的格子 ， 在0.1mm2的中心区域刻有400个小方块 ， 通过油镜观察 ， 统计某个大细胞内的微生物数量 ， 进而计算出1 ml菌液中所含的细菌数量 。这种方法简单、直观、快速 ， 但只适用于计数单细胞微生物或丝状微生物产生的孢子 ， 结果是细菌总数包括死亡细胞 。
染料计数方法:
为了弥补某些微生物在油显微镜下难以观察和计数 ， 以及血细胞计数平板法无法直接区分死细胞和活细胞的不足 ， 人们发明了染色计数法 。用不同的染料对细菌进行适当染色 ， 在显微镜下计数活菌更方便 。例如酵母的活细胞可以用亚甲蓝染色液计数 。染色后 ， 活细胞无色 ， 死细胞呈蓝色 。
比例计数法:
将已知颗粒浓度的液体(如霉菌孢子或红细胞)与待测细胞浓度的细菌溶液按一定比例混合均匀 ， 在显微镜视野内分别计数 ， 得到未知细菌溶液的细胞浓度 。这种计数方法比较广泛 。应按照标准制备已知颗粒浓度的悬浮液 。
液体稀释法:
未知细菌样本连续稀释十倍 。据估计 ， 从最合适的三个连续十倍稀释液中抽取5ml样品 ， 接种到含培养液的1ml至三组15支试管中 。培养后 ， 记录每次稀释时生长的试管数量 。然后 ， 利用最大概率表MPN(Most Probability Number)得到细菌样本中的细菌数量 ， 并根据样本的稀释倍数计算活菌含量 。这种方法常用于食品中微生物的检测 ， 如饮用水和牛奶的微生物限度检查 。
平板菌落计数法:
这是最常用的活菌计数方法之一 。对待测菌液进行梯度稀释 ， 在固化前将一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基混合均匀 ， 或将菌液涂在固化的固体培养基板上 。孵育后 ， 将平板上出现的菌落数乘以细菌溶液的稀释度 ， 以计算原始细菌溶液中包含的细菌数 。直径9cm的平板上一般出现50-500个菌落 。但是方法比较麻烦 ， 需要操作人员熟练 。平板菌落计数法不仅可以获得菌液中活菌的数量 ， 而且可以一次性分离培养菌液中的细菌 ， 获得单克隆抗体 。
试纸法:
在平板计数法的基础上 ， 为快速计数开发了小型商品 。有小而厚的滤纸片 ， 琼脂片等 。将合适的培养基吸入滤纸和琼脂平板中 ， 并将活性指示剂2 ， 3 ， 5-三苯四唑氯化物(TTC ， 无色)加入到滤纸和琼脂平板中 。将试验菌溶液浸泡后 ， 在密封的包装袋中培养 。短期培养后 ， 滤纸上出现一定密度的玫瑰色小菌落 ， 与标准纸色板上的图谱进行比较 ， 即可估算出样品的细菌含量 。试剂纸法快速准确 ， 避免了平板计数法的人工操作误差 。
膜过滤方法:
用专用滤膜过滤一定体积的含菌样品 ， 在紫外显微镜下观察细胞荧光 。活细胞呈橙色荧光 ， 死细胞呈绿色荧光 。
生理指标法:
微生物的生长随着一系列生理指标的变化而变化 ， 如发酵液的pH值、含氮量、含糖量和产气量等 。与生长量平行的生理指标有很多 ， 可以作为生长测量的相对值 。氮含量的测定:
大多数细菌的含氮量为12.5% ， 酵母为7.5% ， 霉菌为6.0% 。根据氮含量×6.25 ， 可以测定粗蛋白含量 。测定氮含量的方法有很多 ， 如用硫酸、高氯酸、碘酸、磷酸等消解 。还有杜马斯测量N2气体的方法 。杜马斯测量N2气体的方法是将样品与氧化铜混合 ， 在CO2气流中加热产生氮气 ， 用呼吸计收集 ， 用氢氧化钾吸收CO2 ， 测量N2量 。
碳含量的测定:
将少量(干重0.2-2.0毫克)生物材料混合到1毫升水或无机缓冲溶液中 ， 然后用2毫升2% K2Cr2O7溶液在1000℃加热30分钟 ， 然后冷却 。加水稀释至5 ml ， 读取580nm处吸光度 ， 计算生长量 。需要使用试剂作为空白对照 ， 使用标准样品作为标准曲线 。
还原糖的测定:
还原糖通常指单糖或寡糖 ， 可被微生物直接利用 。还原糖的测定可以间接反映微生物的生长状态 ， 常用于大规模工业发酵生产中微生物生长的常规监测 。方法如下:发酵液离心 ， 取上清液 ， 加入费林试剂 ， 沸水浴煮沸3分钟 ， 取出加少许盐酸酸化 ， 接近终点时加入淀粉溶液 ， 继续加入Na2S2O3至终点 ， 查表读出还原糖含量 。


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