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突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！( 二 )


尽管SMC策略在一些癌症病例中得到了成功的验证 ， 但本次研究还进一步评估了所有受试者下叶刷检标本中1 651个SSMs的一些特征 ， 并将它们与应用相同工具时2个癌症病例中的（真阳性和假阳性）警示进行了比较 。 在染色体分布、结构注释、与DHS重叠或重复区域以及突变类型等方面 ， 这些警示未显示出实质性差异（图2） 。
突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！
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图2  EvA研究（N = 12）受试者肺刷和2例癌症患者肿瘤组织中基于同一警示过程的体细胞单核苷酸突变特征
覆盖率和vaf基于Strelka结果 。 MB = 髓母细胞瘤；CLL = 慢性淋巴细胞白血病；DHS = DNA酶I超敏位点；IQR = 四分位区间；VAF = 变异等位基因频率 。
总的来说 ， 许多位置的VAF结果不支持个体刷毛中存在变异的等位基因 ， 这表明基于WGS的SMC结果中存在相当多的假阳性警示（表3） 。
表    3
突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！
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选定的体细胞单核苷酸突变（SSM）呼叫的验证分析 ， 按置信类别分层 。 85个SSM呼叫中只有一个被确认 。
总之 ， 验证分析只能确定一个预测的SSM 。 推断这一结果将使我们在1 651个呼叫中只剩下少数正确的SSM ， 剩下的99%可能是误报 。 只有在序列覆盖率、区域复杂性和与多态性数据库重叠方面的严格要求得到满足时 ， 才保证对常见SMC工具的重叠输出具有高度的信心 。
03
讨  论
在先前有研究中 ， 通过中等深度测序 ， 可在健康组织中的大量体细胞突变称为突变 。 因此 ， 本研究的科学家们 ， 应用了一种类似的方法 ， 在COPD病例和对照组的气道刷毛中 ， 使用全基因组调用SSMs ， 来看看有没有差别 。 虽然例数很少 ， 仅能算个预实验 ， 但是他们的“科学假设” ， 听起来还是很有道理的 ， ------在以前的对照组和从未吸烟的对照组之间至少检测到不同的数字 。 然并卵 ， 在这项研究中 ， 他们并未检测出大量的SSMs 。
作为阴性结果的论文 ， “讨论”理所当然地成为最精彩的部分（你们不解释清楚 ， 人家凭啥给发表呢？）
首先 ， 科学家们寻找证据 ， 来解释这一观察结果 。 他们推测 ， 戒烟多年后 ， 对强变异肺祖细胞的阴性选择 ， 最终导致既往吸烟者和非吸烟者之间变异水平的协调 。 然而 ， 有令人信服的证据表明 ， 既往吸烟者气道中积累了更多的突变 。 首先 ， 在选定的染色体位点上 ， 对吸烟者序列不稳定性的研究 ， 支持这样的观点 。 其次 ， 与从不吸烟者相比 ， （现在和以前）吸烟者肿瘤的突变负荷明显增加 。 再者 ， 在流行病学研究中 ， 戒烟者患肺癌的风险从来没有恢复到从不吸烟者的水平 。 此外 ， 在刷状标本的气道上皮细胞中未能检测到有意义的突变标记 ， 可能与其组织的可用性不匹配 。
（读到这里 ， 笔者想问 ， 科学家们是要“甩锅”给检测技术吗？那好 ， 大家就一起看看“甩锅”喽 。 但在甩锅之前 ， 科学家们计算工具 ， 又做了一次检查 。 ）
在这项研究中 ， 出现大量的假阴性 。 不可否认 ， 从不同调用工具派生的交叉结果容易导致许多假否定 。 然而 ， 在前期研究以及我们对癌症数据的验证中 ， 所有3个呼叫者都显示出合理的敏感性（计算工具们表示：这个锅我们不背） 。
在大量样本中 ， 在特定位置检测变异等位基因的能力取决于支持该变异的读取比例 。 这一比例与携带变异等位基因的细胞数量与细胞总数有关 。 它可靠地调用变异等位基因的存在所需的最小值 ， 也根据该位置的可用读取深度而变化（图3） 。
突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！
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图3  支气管上皮中突变克隆的表达


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